昏睡状態の誘発 | 福州島熱有限公司

Nature Metabolism volume 5、pages 789–803 (2023)この記事を引用

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984 オルトメトリック

メトリクスの詳細

休眠状態とは、動物が過酷な環境条件を生き抜くために代謝率と体温を大幅に低下させるエネルギー節約状態のことです。今回我々は、視床下部視索前野（POA）における遠隔経頭蓋超音波刺激による、げっ歯類における不眠様の低体温および低代謝状態の非侵襲的、正確かつ安全な誘導を報告する。私たちは、体温の自動検出を備えた超音波刺激の閉ループフィードバック制御を介して、マウスで長時間（24時間以上）の無気力状態に似た状態を実現します。超音波誘発性低体温および代謝低下（UIH）は、POA ニューロンの活性化によって引き起こされ、下流の脳領域として視床下部背内側が関与し、その後の熱産生褐色脂肪組織の抑制が関与します。 POA ニューロンの単核 RNA 配列決定により、TRPM2 が超音波感受性イオンチャネルであることが明らかになり、そのノックダウンにより UIH が抑制されます。我々はまた、UIH が非鈍足動物であるラットでも実行可能であることを実証します。私たちの発見は、UIHが非侵襲的かつ安全に不眠様状態を誘導するための有望な技術であることを確立しています。

冬眠と同様に、休眠は、哺乳類がエネルギーを節約し、致命的な状態や低温の環境温度を生き延びるために、代謝を積極的に抑制し、体温を下げ、他の生きているプロセスを遅くする生理学的状態です1。人工的手段によって無気力のような低体温と代謝低下を引き起こすという概念は、長期の有人宇宙飛行中のエネルギー消費を削減するための生物医学的解決策として 1960 年に初めて提案されました 2,3。昏睡状態のような低体温症や代謝低下は、代謝や病気の進行を遅らせることにより、生命を脅かす状況（心臓発作や脳卒中など）にある患者の生存確率を高める可能性もあります4。

非侵襲的で安全な無気力状態の誘導は、映画や小説に限定された SF の話と考えられてきました 5,6。数十年の研究にもかかわらず、まだ達成されていません。当初の概念では、冬眠は内因性血液物質によって制御されていると提案され 7 、全身的に代謝を抑制することで無気力状態に似た状態を誘導する内因性物質の探索に多大な努力が払われました 8,9。現在、休眠は中枢神経系 (CNS) によって制御され、多数の機能を正確に調整していると考えられています 10、11、12。 CNS 経路を標的とする薬剤を直接頭蓋内に注射すると、自然の休眠に似た深い低体温状態が誘発されることが報告されました 13,14。最近の画期的な研究により、げっ歯類の休眠と冬眠を調節する視床下部 POA のいくつかのニューロン集団が特定されました 11、12、15。光遺伝学的および化学遺伝学的操作のためのこれらのニューロン集団の遺伝子工学により、マウスにおける不眠/冬眠の重要な行動的および生理学的特徴が得られました11、12、15。昏睡状態の誘導におけるこれらの技術的進歩は有望であるが、これらのアプローチは外科的介入または遺伝子工学を必要とし、これらのアプローチの広範な適用およびヒトへの翻訳は制限される。

超音波は、非侵襲的に頭蓋骨を貫通し、電離放射線を使用せずにミリ単位の精度で脳内の任意の場所に焦点を合わせることができる唯一の利用可能なエネルギー形式です 16,17。これらの機能とその安全性、携帯性、低コストにより、超音波は小動物 18,19、非ヒト霊長類 20,21 および人間 16,22 の神経調節に有望な技術となっていますが、そのメカニズムは依然として解明されていません。ここでは、POAでの遠隔超音波刺激によるマウスの無感覚状態の非侵襲的、正確かつ安全な誘導を報告します（図1a）。我々は、このUIHが、休眠関連POAニューロンで発現するTRPM2イオンチャネルの超音波活性化と関連していることを発見した。我々は、UIHの制御における下流の脳領域としての視床下部背内側と、エフェクター組織としての褐色脂肪組織の潜在的な関与を明らかにした。我々はまた、POA での超音波刺激が非昏睡動物であるラットの低体温症を誘導することに成功したことも実証した。

a、超音波（US）によって引き起こされる無感覚状態の図。 b. ウェアラブル US プローブの図 (上)。プローブは、マウスの頭に接着されたベースプレートに差し込まれました。ウェアラブル US プローブを使用したマウス頭部の MRI は、超音波が POA を非侵襲的にターゲットにしていることを示しています (挿入)。ウェアラブル US プローブを取り付けた自由に動くマウスの写真を下部に示します。 c、この研究で使用された US 刺激波形の図。 ISI、刺激間間隔。 PD、パルス持続時間。 PRF、パルス繰り返し周波数。 d. US プローブの表面 (上) と内部 (下) の温度 (T) 上昇の校正。 US プローブが POA または皮質をターゲットにしている場合、プローブ内部の温度は圧電材料とマウスの頭部の間で測定されました。 Cortex をオフターゲットコントロールとして選択しました。米国の超音波処理はピンクのバーで示されます。 n = 6 匹のマウス (上) および n = 4 匹のマウス (下)。実線と影は平均値 ± sem を示します。

ソースデータ

自然な休眠は、低体温、代謝低下、活動低下という重要な特徴によって特徴付けられます11,23。我々は、餌と水を自由に摂取できる自由に動くマウスのPOA領域に遠隔から超音波を届けるために、「プラグアンドプレイ」ウェアラブル超音波トランスデューサー（図1bおよび拡張データ図1）を設計しました。まず、熱赤外線カメラでマウスの体温変化を記録し、超音波刺激中および超音波刺激後に、褐色脂肪組織（BAT）が存在する肩甲骨間領域（TBAT）の皮膚温度の大幅な低下を発見しました（図2aおよび補足ビデオ1）。（音圧1.6 MPa、周波数3.2 MHz、パルス持続時間50 ms、パルス繰り返し周波数10 Hz、刺激持続時間10秒、刺激間隔30秒、刺激の総数6）。 BATの温度低下のこの観察は、尾部温度の上昇と同期していました（図2a、b）。げっ歯類の体温調節の基礎となる 2 つの主な機構は、BAT 熱発生 (震えのない熱産生を可能にする) と尾血管拡張 (熱放散を可能にする) です。これらの発見は、マウスにおけるPOAの超音波刺激が熱産生を抑制し、熱損失を開始して低体温症を誘発することを示した。動物の行動のビデオ記録は、POAの超音波刺激も運動活動の低下と相関していることを示しました（図2b）。

a、POA で US 刺激を受けたマウスの赤外線熱画像 (上) と写真 (下)。 US トランスデューサープローブは点線の円でマークされています。 b、POA で US 刺激を受けたマウス (US+、n = 12 マウス) の BAT 温度 (TBAT)、尾部温度 (Ttail) および身体活動を、2 つの対照群と比較しました: US 超音波処理を行わなかったマウス (US-、n = 12 マウス)およびオフターゲット対照として皮質に US 刺激を与えたマウス (オフターゲット、n = 6 マウス)。米国の超音波処理はピンクのバーで示されます。 c、US+（Tcore については n = 13 マウス、VO2 および RQ については n = 17 マウス）、US-（ Tcore および n = 18 マウス（VO2 および RQ の場合）およびオフターゲットグループ（n = 4 マウス（Tcore、VO2 および RQ の場合））（上、左から右）。 Max ΔTcore (最低 Tcore – US 前の平均 Tcore)、max ΔVO2 (最低 VO2 – US 前の平均 VO2)、および max ΔRQ (最低 RQ – US 前の平均 RQ) (下、左から右)。雄と雌のマウスは、それぞれ青とピンクの点で表されます。 d、US刺激前（上）とUS刺激後（下）のマウスの代表的なECGトレース。 e、US + (n = 9 マウス)、US- (n = 5 マウス)、およびオフターゲット (n = 5 マウス、海馬を標的とする) グループの US 刺激前後の心拍数 (左)。記録時間全体を通して、オフターゲットグループと米国グループの間に有意差は見つかりませんでした。 US 刺激前の心拍数と、US 刺激後 10 分以内の POA での US 刺激によって達成された最低心拍数の比較 (右)。 bpm、1分あたりの拍数。実線と影は平均値 ± sem を示します。エラーバーは sem を示します。各点は 1 匹のマウスを表します。 P 値は、一元配置分散分析に続いて、US+ グループとオフターゲットグループを US- グループとそれぞれ比較する c および e (左) のダネット事後検定と、対応する両側 t 検定を使用して計算されました。 e（右）。

ソースデータ

次にマウスを代謝ケージに入れ、酸素消費率 (VO2) と呼吸商 (RQ = VCO2 / VO2) を分析することで、POA の超音波刺激前、刺激中、刺激後の代謝を評価することができました。これらのマウスの腹腔内にワイヤレス温度センサーが埋め込まれ、同時に深部体温 (Tcore) が測定されました。超音波刺激により、深部体温（最大 ΔTcore = −3.26 ± 0.19 °C）（図 2c）および VO2（36.61 ± 1.74%）（図 2c）が顕著に減少しました。これらの効果量は、以前に報告されたマウスの絶食誘発性無気力と同様でした 11,24。超音波は、体温が低下する前に酸素消費を抑制しました（拡張データ図2b、c）。これは、低体温の二次効果ではなく、代謝の積極的な阻害を示唆しています。体温未満の Tcore 低下の持続時間は UIH によって 51.98 ± 5.52 分であり (拡張データ図 2d)、これは自然の休眠状態に匹敵しました 24,25。超音波も RQ を 0.72 ± 0.01 に減少させました (図 2c)。 0.7 に近い RQ は、UIH がエネルギー基質の利用を炭水化物と脂肪の混合物から脂肪酸化への依存に切り替えたことを示しており、これは鈍感な動物の共通の特徴として確立されています 26。 UIH を受けたマウスは、低体温および低代謝状態から自然に正常状態に回復しました。これは、自然不眠の重要な特徴でもあります 5,11,12。心電図（ECG）記録は、UIHが心拍数を47.3％減少させることを示し、これは超音波刺激前および超音波刺激なしのグループよりも有意に低かった（図2d、e）。これらの生理学的状態は、超音波刺激なしのマウス、またはターゲット外の位置（皮質および腹側海馬）での超音波刺激ありのマウスでは観察されませんでした（図2b〜eおよび拡張データ図3）。超音波圧電材料によって生成される熱などの非特異的効果ではなく、POA 特異的刺激によって引き起こされました（図 1d）。超音波処理後のマウス脳の免疫組織学的検査では、脳内に目に見える損傷や炎症は見つかりませんでした（拡張データ図 4）。上記の実験はすべて室温 (約 22 °C) で実行されました。低温 (6 °C) および中温 (30 °C) の周囲温度で実験を繰り返したところ、低体温と代謝低下がうまく引き起こされることがわかりました (拡張データ図 5)。 UIH の効果サイズは、周囲温度が低下するにつれて増加しました (拡張データ図 5)。これは、UIH の効果が周囲温度によって調整される可能性があることを示唆しています。

次に、低体温症の深さと持続時間を正確に制御する超音波の機能を調査しました。誘導された状態を正確に制御するこの能力は、無感覚のような状態をうまく操作するための鍵となります。超音波が脳に及ぼす影響は、音圧や刺激持続時間などの多くのパラメータに依存します。最大ΔTBATによって測定されるように、より高い音圧と刺激持続時間がUIHの深さを増加させることを観察しました（図3a、b）。この研究でテストされたパラメータ空間の下で ΔTBAT に大きな変化を引き起こすには、0.8 MPa より高い音圧が必要でした。超音波出力をバイナリ制御することで、長時間安定したUIHを実現する自動閉ループフィードバックコントローラを開発しました。概念実証として、閉ループフィードバックコントローラーは、マウスの自然な休眠の基準として以前に報告されている34℃未満に望ましい体温（Tset）を設定しました27（図3c）。コントローラーは深部体温センサーから入力信号を継続的に受信し、Tcore > Tset の場合は超音波刺激をオンにし、Tcore ≤ Tset の場合は超音波刺激をオフにします。中核体温は合計 30 時間記録され、フィードバック制御された超音波処置は 24 時間継続されました。結果は、フィードバック制御されたUIHがマウスの体温を約24時間（24.90±0.63時間）32.95±0.45℃に維持したことを示しました（図3d、e）。マウスは、コントロールと比較して、フィードバック制御されたUIHでは食物摂取量の減少と体重減少を示しました（図3f）。マウスの体温は、フィードバック制御されたUIHが終了してから54.18±35.56分後に正常レベル（>34°C）に徐々に回復しました（拡張データ図2e）。閉ループフィードバック制御システムは、非侵襲的かつ正確な UIH の誘導に対する超音波と脳のインターフェース技術の大きな可能性を明らかにしています。

a、異なる音圧 (左) と刺激持続時間 (右) で US 刺激を使用して測定した TBAT。曲線の実線と影は、平均 ± sem b、最大 ΔTBAT (最低 TBAT − US 前の平均 TBAT) と音圧 (左) または刺激持続時間 (右) の相関関係を示します。 0.4 MPa、1.2 MPa、2 秒、4 秒および 6 秒のグループでは n = 4 匹のマウス。 0-MPa および 0-s グループの場合は n = 7。 0.8 MPa および 8 秒グループの場合は n = 3、1.6 MPa および 10 秒グループの場合は n = 6)。誤差バーは sem c、長時間 UIH を達成するための閉ループフィードバック制御システムの概略図 (BioRender.com で作成) を示します。 d、閉ループフィードバック制御UIHを使用して1匹のマウスで測定された代表的なTcore。米国の各刺激はピンクの点で表されます。 e. 平均 Tcore (左) と、閉ループフィードバック制御システムによって達成された Tcore < 34 °C の持続時間 (右) の定量化。 f、対照マウス（US-、n = 4マウス）と比較した、閉ループフィードバック制御UIHを受けたマウス（US+、n = 4マウス）の食物摂取量（左）および体重変化（右）。箱ひげ図の場合、中心線と箱の境界は平均 ± sem を示します。P 値は対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

UIHの神経機構を理解するために、我々は、生体外蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）と、超音波標的POA領域における神経活動マーカーFosの免疫蛍光染色から始めました（図4aおよび拡張データ図6）。 Fos発現は、内側視索前野（MPA; 10.17 ± 1.30% vs 1.85 ± 0.69%）、内側視索前核（MPO; 7.58 ± 0.51% vs 1.38 ± 0.57%）および心室周囲核（Pe; 6.68 ± 1.39%）で高かった。対 1.43 ± 0.82%) (図 4b)。次に、超音波に応答したPOAのニューロン活動のダイナミクスを研究しました。我々は、POAニューロンでカルシウム（Ca 2 + ）レポーターGCaMP6を発現させ、同じ領域に光ファイバーを設置し、ファイバー測光法を使用して超音波刺激前、刺激中、後のCa 2 + 活性の動態を継続的に記録しました（図4c）。各超音波パルスに応答して、ニューロン活動が一貫して堅牢かつ繰り返し増加することを観察しました（図4d）。超音波刺激中に記録されたニューロン活動は、ピーク振幅 (0.17 ± 0.30 から 2.03 ± 0.42)、平均 Z スコア (0.09 ± 0.28 から 1.69 ± 0.40)、およびピーク周波数 (0 から 5.7 ± 1.08) の上昇によって特徴付けられました。 min−1）、超音波刺激前に測定されたニューロン活動と比較しました（図4e）。 Ca2+活性変化の傾向は体温変化の傾向と一致していました（図4d）。これらの発見により、UIH は POA ニューロンの超音波活性化によって誘発されることが明らかになりました。 POAの経頭蓋刺激がUIHを誘発するのに十分であるという我々の発見は、マウスにおける無力状態のような状態の調整におけるPOAの重要な役割を明らかにした。

a、上: US 刺激あり (US+) およびなし (US-) のマウスにおける POA 領域の Fos マーカーの in situ ハイブリダイゼーション分析。挿入図は、これらの画像が取得された脳領域を示しています。マウス脳アトラスに記録された Fos シグナルの空間分布 (下)。 LPO、外側視索前野。 VLPO、腹外側視索前核。 VMPO、腹内側視索前核。 b、US+ および US- グループの異なる POA 脳領域における Fos+ 細胞の割合。 US+ グループでは n = 6 マウス、US- グループでは n = 4 マウス。ただし、US+ グループの VLPO 定量では n = 5 マウスを使用しました。エラーバーは sem c、US がターゲットとする POA におけるニューロン Ca2+ 活動のファイバー測光記録の概略図 (BioRender.com で作成) (左) を示します。マウスの MRI は、POA 領域 (右) での光ファイバー (緑色の点線) と US トランスデューサー (茶色) の共焦点位置合わせを示します。ｄ、ＵＳ刺激を受けたＰＯＡニューロンの代表的なＣａ２＋活性（上）および対応するＴＢＡＴ曲線（下）。 US 刺激は 6 つの個別の刺激で構成されます。 e、n = 7 匹のマウスからの各 US パルスに応答した Ca2+ シグナル。この Ca2+ シグナルに基づいて、US 刺激前 (5 秒)、刺激中 (10 秒)、刺激後 (15 秒) の 3 つのウィンドウでピーク振幅、平均 Z スコア、および周波数を定量化しました (n = 7 マウス)。箱ひげ図の場合、中心線と箱の境界は平均 ± sem を示します。 P 値は、対応のない両側 t 検定 (b) および対応のある両側 t 検定 (e) によって計算されました。

ソースデータ

UIH の誘導に関連する POA ニューロン (POAUIH ニューロン) の活性化を可能にする超音波感受性分子を同定するために、超音波を標的とした POA 領域のハイスループット単核 RNA シーケンス (snRNA-seq) を実行しました。我々は、POA領域を解剖し（US+グループではn = 4マウス、US-偽グループではn = 4マウス）、それらを解離して単一核を収集し、NeuNマーカーを使用してニューロンから核を事前選択しました。教師なしグラフベースのクラスタリングを使用して、21,886 個のニューロンを含む合計 35 個の多様なニューロンクラスター (図 5a) が特定されました 28。それらのうち、11個のクラスターが興奮性（2個のハイブリッドクラスターを含む）、24個が抑制性（3個のハイブリッドクラスターを含む）（図5b）であり、これはPOAの細胞型の高い多様性と一致しています11,29。最近の研究により、休眠関連ニューロンは、Adcyap1 (アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド-1 をコードする)11、Qrfp (ピログルタミル化 RFアミドペプチド)12、Esr1 (エストロゲン受容体-1)15 などの特定の遺伝マーカーによって特徴づけられることが特定されました。さらに、これらのニューロンの大部分は、興奮性またはハイブリッドのいずれかに分類されました。これら 3 つのマーカーを使用して、k-means クラスタリング 30 を実行することで不眠関連ニューロンを特定し、興奮性ニューロンまたはハイブリッドニューロンである 7 つの不眠関連クラスターを発見しました（図 5b）。

a、21,886 個の神経核の均一多様体近似および投影 (UMAP) プロット。異なる色は異なるニューロン集団を表します。 3 つの主要な代表的なクラス特異的マーカー遺伝子の発現レベルは、UMAP 上で色分けされています (青色): 抑制性クラスターの場合は Gad1、興奮性クラスターの場合は Slc17a6、および不眠関連クラスターの場合は Adcyap1+。 b、さまざまな神経細胞タイプにわたる興奮性および抑制性マーカー遺伝子の発現（K 平均法クラスタリングによって整理）（上）。興奮性ニューロン集団およびハイブリッドニューロン集団全体にわたる休眠関連マーカー遺伝子 (Adcyap1、Esr1、および Qrfp) の発現 (これらの休眠関連遺伝子に基づいてクラスター化) (中央)。すべての休眠関連クラスターにわたる TRP および PIEZO チャネルファミリーをコードするすべての遺伝子の発現。これらは IEG の発現レベルによってランク付けされました (下)。ピンクのバーは、US によってアクティブ化されたクラスターを示します。 c. Trpm2 の発現レベルは UMP 上で色分けされています (青)。 US によって活性化された torpor 関連 h0 クラスターがプロット内でラベル付けされています。 d、異なるレベルからの2つの冠状切片のPOA領域におけるAdcyap1およびTrpm2の代表的なFISH画像。 FISH 分析を 5 匹のマウスで繰り返しました。ブレグマに対する前後座標は、Allen Mouse Brain Atlas62 に基づいて示されています。

超音波神経調節について一般に受け入れられている仮説は、内因性の超音波感受性イオンチャネルの活性化です。以前の研究では、PIEZOおよびTRPファミリー（PIEZO1 / 2（参考文献31、32）、TRPA1（参考文献33）、TRPV1（参考文献34）、TRPP1/2およびTRPC1（参考文献34）を含む）からのいくつかのイオンチャネルの活性化が報告されていますが、 35))、これらの研究は主に培養細胞を使用して in vitro で行われました。脳内のニューロン上の超音波感受性イオンチャネルを明らかにするための候補イオンチャネルをスクリーニングするための生体内研究は行われていない。ここでは、TRP (TRPV、TRPM、TRPC、TRPP、TRPA、TRPML) および休眠関連興奮性ニューロンの PIEZO チャネルファミリーのすべての遺伝子を調べ、TRPV、TRPM、TRPC を含む TRP チャネルファミリーをコードする遺伝子の広範な発現を発見しました。、TRPAおよびPIEZOイオンチャネル（図5b）。次に、7 つの休眠関連ニューロン集団すべての中で、前初期遺伝子 (IEG) としても知られる Fos、Fosb、Nr4a1、Egr1、Dusp1 を含む 5 つのニューロン活性化マーカーの高発現を特徴とする特定の集団を特定しました。この神経細胞集団は超音波によって活性化されたと考えられます。超音波活性化休眠関連ニューロン集団 POAUIH ニューロンを指します。すべてのTRPおよびPIEZOチャネル遺伝子を評価することにより、POAUIHニューロンではTRPM2の発現レベルが高いことがわかりました（図5b、c）。

TRPM2イオンチャネルが超音波に感受性であることを確認するために、ex vivo FISH分析を実行したところ、Trpm2がFosと共発現しており、共発現率は27.53±9.75％であることがわかりました（図6a、b）。次に、TRPM2 を HEK293T 細胞で過剰発現させることにより、TRPM2 の超音波感受性をさらに評価しました。超音波は、野生型細胞では観察されなかった、TRPM2を過剰発現する細胞におけるCa2+流入の誘導に成功したことを発見した（図6c、d）。 TRPM2+細胞における超音波誘発Ca2+反応は、TRPM2ブロッカー2-APBによって有意に抑制されました（図6c、d）。これらの発見は、TRPM2 が超音波感受性のイオンチャネルであることを強く裏付けています。

a、Fos と Trpm2 の代表的な FISH 画像。 Fos と Trpm2 を共発現する細胞は丸で囲まれています。 b、Trpm2の発現を欠く集団(Trpm2-)と比較した、Trpm2を発現する集団(Trpm2+)におけるFos+細胞の割合。 n = 4 匹のマウス。 c、TRPM2過剰発現なし（左）、TRPM2過剰発現あり（中央）、およびTRPM2過剰発現および2-APBブロッカーあり（右）のin vitro HEK293T細胞の蛍光Ca2+画像。米国による刺激前（上）。米国による刺激後（下）。 n = 5 つの独立したテスト。 WT、野生型。 d、これら 3 つのグループの 5 つの独立したテストからランダムに選択された 100 個の細胞の正規化された Ca2+ シグナル (ΔF/F) のヒートマップ。点線は、US 刺激のオン時間とオフ時間を示します。 e、TRPM2をノックダウンするためにshRNAを注射したマウス（TRPM2-KD）のΔTBAT（ベースラインに対するTBATの変化）（左）。最大 ΔTBAT (右) は、左のプロットに基づいて、US 刺激の開始後の 7 ～ 12 分間の最低 ΔTBAT として決定されました。偽のグループには、スクランブル shRNA が注射されました。偽グループでは n = 5 マウス、TRPM2-KD グループでは n = 7 マウス。 f、偽群と比較したTRPM2-KDマウスにおけるUS超音波処理に応答したCa2+シグナル（ピンクのバー）。 TRPM2-KD グループと偽グループの Ca2+ 曲線のピーク振幅を定量化しました。偽グループでは n = 8 マウス、TRPM2-KD グループでは n = 10 マウス。曲線の実線と影は平均値 ± sem を示します。エラーバーは sem を示します。US 刺激はピンクのバーでマークされます。 P 値は、b と e で対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。 US 刺激前と刺激中のピーク振幅を比較する場合、f では対応のある両側 t 検定を使用しました。

ソースデータ

TRPM2イオンチャネルがUIHに関与していることを検証するために、in situハイブリダイゼーション分析を実行したところ、Trpm2が35.7±5.3％の共発現率で、運動神経関連ニューロンの分子マーカーAdcyap1と共局在していることがわかりました（図5d）。レンチウイルス-shRNAを使用してPOA領域のTRPM2発現レベル（TRPM2-KD）を特異的にノックダウンすることにより、UIHにおけるTRPM2の役割をさらに調査しました。ウェスタンブロット分析により、TRPM2 のノックダウンが成功したことが確認されました (拡張データ図 7)。 TRPM2-KD マウスは UIH を大幅に減少させました。 TBAT温度の低下は、対照と比較してTRPM2-KDマウスで41.2％減少しました（図6e）。 POA における超音波誘発 Ca2+ シグナルの振幅は、TRPM2-KD マウスではほぼベースラインまで減少しました（図 6f）。これらの発見は、TRPM2 が UIH の誘導に関与していることを実証しました。

次に、UIH中のPOAニューロンの活性化に関連する潜在的な下流脳領域を研究しました。代謝および熱調節は、POA の後方の視床下部領域に位置する視床下部背内側 (DMH)36,37、弓状核 (ARC)36、および視床下部腹内側 (VMH)36 への POA 投影によって調整されていることが以前に報告されています。我々は、POA での超音波刺激後、これらの視床下部領域の Fos マーカーの FISH 分析を実行しました。 DMH、ARC、視床下部外側部（LH）を含む複数の視床下部領域でFos発現の増加が検出されました（図7a、b）。最も高いFos発現はDMHで観察されました（US+で6.00±0.91％）（図7b）。UIH中のDMH神経活動を研究するために、同時にPOAで超音波をターゲットにしながら、ファイバー測光を使用してDMH領域のCa2+シグナルを記録しました（図7c)。我々は、POAでの超音波刺激中にDMHニューロンのCa 2 + シグナルの平均ピーク振幅が増加することを観察しました（0.04±0.20から0.41±0.15;図7d、e）。これは、DMHニューロンの活性化がUIHに関連していることを示しています。これらの結果は、DMH が UIH を調節する神経回路に潜在的に関与している一方、他の脳領域 (ARC や VMH など) も無力神経ネットワークのノードとして機能している可能性があることを示しました。

a、US刺激あり（US+）およびなし（US-）のマウスのDMH周囲の視床下部領域におけるFosマーカーのFISH染色（左）。これらの画像の位置は脳地図帳に示されています (挿入)。マウス脳アトラスに記録された Fos シグナルの空間分布 (右)。 TU、嗅結節。 b、US+ および US- マウスの DMH、ARC、LH、VMH、および TU における Fos+ 細胞の割合。 US+ グループでは n = 5 マウス、US- グループでは n = 4 マウス。エラーバーはsem c、POAをターゲットとしたUSと同時にDMHにおけるニューロンCa2+活性を測光記録するためのセットアップを示す。ｄ、ＵＳ刺激中のＰＯＡニューロン中のＤＭＨニューロンのＣａ２＋活性。 n = 5 匹のマウス。曲線の実線と影は、POA領域でのUS刺激前、刺激中、刺激後のDMHニューロン活動の平均±sem、ピーク振幅（左）、平均zスコア（中央）、および頻度（右）を示します。 n = 5 匹のマウス。 f、UIHがUCP1依存性のBAT熱産生およびエネルギー消費によって媒介されるという仮説の説明。 g、WT マウスと UCP1 ノックアウト (UCP1-KO) マウスを比較した US 刺激中の Tcore (左)。最大 ΔTcore (最低 Tcore – US 前の平均 Tcore) (右)。 h、WT および UCP1-KO マウスにおける US 刺激中の VO2 (左)。最大 ΔVO2 (最低 VO2 – 超音波刺激前の平均 VO2) (右)。 g および h では、曲線の実線と影は平均値 ± sem を示します。誤差バーは標準偏差を示します。 WT グループでは n = 6 マウス、UCP1-KO グループでは n = 5 マウス。 P 値は、対応のない両側 t 検定 (b、g、h) および対応のある両側 t 検定 (e) を使用して計算されました。 c と f は BioRender.com で作成されました。

ソースデータ

視床下部は、末梢エフェクター組織の熱産生とエネルギー消費を変化させる交感神経系と関係していることが知られています 38。 UIH中のBAT温度の低下を観察しました（図2a、b）。これは、BATがUIH神経回路の下流エフェクター組織であることを示しています（図7f）。 UCP1 は BAT 熱産生に関与する重要なミトコンドリアタンパク質であるため 39、我々は UIH に UCP1-KO マウスを使用し、Tcore と VO2 の変化を野生型コントロールの変化と比較しました。超音波誘発性低体温の深さ（最大ΔTcoreで測定）は、UCP1-KOマウスでは野生型マウスよりも約2.2倍低いことがわかりました（図7g）。代謝低下の程度（最大ΔVO2で測定）は、UCP1-KOマウスでは野生型マウスよりも1.7倍低かった（図7h）。しかし、この低体温および低代謝状態は、UCP1-KO マウスでは完全には解消されませんでした。これらの発見により、BAT が UIH 中の体温と代謝率の変化を媒介するエフェクター組織の 1 つであることが確認されました。

マウスは、カロリー制限下で昏睡状態に入る能力を十分に備えています。 UIHが非休眠動物で誘発されるかどうかを評価するために、冬眠も日常的休眠も示さない種であるラットで超音波刺激を実行しました12,14。マウスで使用されているものと同様の設計のウェアラブル超音波トランスデューサーを使用して、自由に移動するラットのPOA領域に超音波が遠隔から送達されました（図1b）。超音波刺激後、特にBAT（TBAT）領域で皮膚温度の低下が見られました（図8a、b）。超音波刺激はまた、ラットにおいて深部体温の有意な低下（最大ΔTcore = -1.33±0.22℃）を誘発した（図8c）。体温低下の程度はマウスよりもラットの方が小さかったが、これらのデータは、非昏睡動物におけるUIHの実現可能性を実証している。

a、POA で US 刺激を受けたラットの赤外線熱画像。 b、POAで超音波処理を受けたラット（US+、n = 12）のTBATを、US刺激なしの対照ラット（US-、n = 4）と比較した。 c、US+ (n = 6) および US- (n = 6) グループの Tcore 曲線 (左)。 US+ グループと US- グループ間の最大 ΔTcore の比較 (右)。曲線の実線と影は平均値±標準誤差を示します。エラーバーは標準誤差を示します。P 値は対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

この研究では、マウスに非侵襲的、正確かつ安全に不眠様状態を誘発するUIH技術を開発しました。私たちは、UIHがPOAニューロンの超音波活性化によって誘発されることを明らかにしました。 POAUIH ニューロンは TRPM2 イオンチャネルを高発現しており、これは超音波感受性があり、UIH の誘導に寄与していることが判明しました。さらに、我々の発見は、UIHにおける下流脳領域としての視床下部背内側、およびエフェクター組織としての褐色脂肪組織の潜在的な関与を示している。我々は、POA での超音波刺激が非昏睡動物 (ラット) で低体温状態を引き起こすことを実証しました。

私たちの発見は、POAの超音波刺激が自然な休眠に似た方法で生理学的プロセスを全体的に抑制することを実証しました。超音波刺激は代謝と熱産生を全身的に抑制し、エネルギー基質の利用を脂肪に切り替え、心拍数を低下させます。これらは総合的に自然不眠の重要な特徴です 11,23。単一の超音波刺激は、最長約 1 時間続く低体温および低代謝状態を誘発することが判明しており、これは自然な不眠と一致しています 24,25。この持続時間の延長は、POA における QRFP ニューロンの光遺伝学的活性化により、1 秒間の光照射後に低体温状態が 30 分以上継続することを発見した以前の報告とも一致していた 12。この状態が比較的長く続くのは、再温暖化中の熱発生のプロセスが遅いことに部分的に起因しています40。この低体温および低代謝状態の維持に関与する神経回路が、超音波刺激によって直接的または間接的に活性化される可能性もあります。 UIH と自然の休眠は類似しているにもかかわらず、下流のエフェクター組織に関してこれら 2 つの状態の間には依然として違いがあります。我々は、BATが、低体温と代謝低下の深さ、およびUIHからの覚醒の両方を調節するUCP1によって媒介されるUIHプロセスに関与していることを発見した（拡張データ図8）。しかし、自然な休眠状態では、UCP1 は低体温や代謝低下の深さではなく、主に休眠からの覚醒に寄与すると報告されています 40。さらに、おそらく血管拡張による熱放散を促進するために、UIH中にマウスの尾部温度が上昇しました。この現象は、絶食誘発性の毎日の休眠状態では報告されていません 41。生理学的特徴、神経回路、効果器組織に関して、UIH 状態と自然の休眠状態の類似点と相違点を特徴づけ、理解するには追加の研究が必要です。

不眠に関連する行動の全体的に調整された制御は、超音波がPOAにおける不眠に関連するニューロン集団を調節したと推測します。実際、単核 RNA 配列決定により、超音波が、Adcyap1、Qrfp、および Esr1 のマーカー遺伝子によって特徴付けられる、以前に報告されている POA における休眠関連ニューロン集団を活性化することが明らかになりました (参考文献 11、12、15)。私たちは、TRPM2 が POAUIH ニューロンの超音波感受性イオンチャネルであることを発見しました。私たちの研究は、超音波が内因性イオンチャネルを活性化することによって脳内のニューロン活動を調節することを明らかにする生体内証拠を提供する。 TRPM2 は、体温を調節する温感受性 POA ニューロンで以前に発見されました 42。 UIHの誘発にはTRPM2が必要であることがわかりました。この研究は、分析に含まれたイオンチャネルの中で POAUIH ニューロンで最も多く発現されたイオンチャネルである TRPM2 に焦点を当てました。 TRPM2 に加えて、我々は、休眠関連ニューロン集団における他の TRP および PIEZO チャネルファミリーの広範な発現も観察しました。 TRPM2ノックダウンはUIHの深さを部分的に抑制したが、UIH効果を完全には消失させなかったことから、他の超音波感受性イオンチャネルまたは分子も低体温および代謝低下を誘発するPOAニューロンの超音波活性化に関与していることが示唆された。

POA ニューロンと TRPM2 イオンチャネルの超音波活性化の生物物理学的メカニズムはまだ解明されていません。 TRPM2 は、Ca2+ 透過性の非選択性カチオンチャネルであり、温度変化に敏感です 43,44。 in vivo 磁気共鳴画像法 (MRI) 温度測定を使用して、超音波処理中の POA 温度を測定しました。 POA での温度上昇は 2.58 ± 0.26 °C (拡張データ図 9) であり、超音波誘発の熱効果が POA ニューロンの活性化に寄与していることを示唆しています。神経活性化とPOA温度上昇の相関関係を分析したところ、神経活性化の開始時間の中央値は1.17秒であることがわかりました。神経活性化開始時の温度上昇中央値は 0.06 °C でした (拡張データ図 9)。このような低い温度上昇は、超音波によって引き起こされる機械的（非熱的）効果もPOAニューロンの活性化に寄与していることを示唆しています。同様に、TRPM2+ HEK293 細胞の超音波刺激中に細胞培養チャンバー内の温度上昇が観察されました。 TRPM2+ 細胞の Ca2+ 活性の開始に対応する温度上昇の中央値は 0.34 °C であることがわかりました (拡張データ図 10)。要約すると、POA ニューロンと TRPM2 イオンチャネルは、超音波の機械的および熱的効果によって活性化される可能性があります。

POA ニューロンは、いくつかの下流の脳領域の活性化を調整して、無力状態を調整します。しかし、この脳全体にわたる複雑な回路はまだほとんど知られていません。我々は、UIHの誘導がPOAでの超音波刺激中のDMHニューロンの活性化と相関していることを発見した。この発見は、Qrfp と Adcyap1 の両方の休眠に関連する POA ニューロンが、遺伝的に誘発されたまたは絶食によって誘発された休眠中に低体温と代謝低下を誘発するために DMH に投射するという以前に報告された神経回路と一致しています 11,12。私たちの研究はまた、ARCなどの他の下流の脳領域もUIHの調整に関与している可能性があることを示唆しています。エネルギー恒常性の調節に重要な視床下部の領域であるARCは、POA15の休眠誘導Esr1+ニューロンからの投射を受け取る重要な下流領域であることが示唆された。これらの発見は、超音波刺激が自然な不眠に関与する神経回路を調節することにより、不眠のような低体温症と代謝低下を誘発することを示唆しています。この研究では、下流のエフェクター組織であるBATがUIH制御に関与していることも判明した。 BAT は以前に熱発生の文脈で研究されていました 39,45 が、不感症制御における BAT の役割は十分に調査されていませんでした 40,46,47。われわれは、BATがUIH中の体温と代謝率の変化を媒介する重要なエフェクター組織の1つであり、これらの影響がUCP1に依存していることを発見した。

UIHは、少なくとも1960年代以来科学界が追求してきた、非侵襲的かつ安全な無感覚状態の誘導を達成するという長年求められてきた目標に取り組む可能性を秘めている。過去には、全身的に代謝を抑制し、無感覚状態を誘発する薬理学的薬剤を特定するために多大な努力が払われてきた。硫化水素 9、アデノシン一リン酸 48、δ-オピオイド 49、N6-シクロヘキシルアデノシン 14,50、および化合物のカクテル 51 などのこれらの薬剤は、解剖学的および機能的特異性を欠き、全身性のオフターゲット副作用 52 を誘発し、そのすべてがその使用を制限しています。最近の研究では、脳への薬剤の外科的注射や、不眠に関連する神経回路の遺伝子操作を通じてCNSを標的とすることによって、不眠を誘発するアプローチが提案されている。これらのアプローチは、不眠の中枢神経経路を研究するために非常に重要ですが、脳への外科的介入や遺伝子工学の必要性により、ヒトへの応用は限られています。他の非薬理学的および非遺伝的神経調節技術（たとえば、脳深部刺激、経頭蓋磁気刺激、および経頭蓋直流刺激）と比較して、超音波刺激は、動物の高い空間的および時間的精度で非侵襲的に脳深部領域に到達する独自の能力を備えています。そして人間の脳。 UIH は、経頭蓋超音波刺激を利用して、休眠の主調節因子である POA を非侵襲的に刺激することにより、低体温症と代謝低下を誘発します。これは、CNS を標的とすることにより、無感覚のような低体温症と代謝低下を誘発する非侵襲的で安全な技術です。

超音波神経調節はヒトでも実行可能であることがすでに実証されているため、UIH はヒトへの応用に大きな期待を寄せています。正当な疑問は、UIH をマウスからヒトに推定できるかどうかです。われわれは、超音波刺激がラットにおいて低体温症を誘発することを示し、ラットは自然には不眠状態にならないが、これはヒトにおいても同様の効果が誘発される可能性を示唆している。ＰＯＡニューロンの正確な超音波制御は、ヒトにおいて無気力のような低体温および代謝低下を達成する可能性があるが、多くの研究を行う必要がある。 UIHは、新しい治療法から長期の有人宇宙飛行に至るまでの応用を可能にするかもしれない。

米国誘発性不眠様低体温および代謝低下効果の最初の特徴付けのために、実験グループにランダムに割り当てられた成体（6〜9週齢）雄および雌のC57BL/6NCrlマウス（Charles River Laboratories）を使用しました。 UCP1 ノックアウトマウス (メス、生後 2 ～ 4 か月) は、J. Brestoff の研究室から提供されました。この研究では、生後 4 ～ 6 週の雌雄の Wistar Han IGS ラット (Charles River Laboratories、系統コード 273) を使用しました。すべてのマウスとラットはワシントン大学医学部の動物施設に飼育されました。動物は、温度管理 (23 ～ 26 °C) および湿度管理 (35 ～ 65%) の環境で、12 時間の明暗サイクルで維持され、標準的な固形飼料が与えられました。すべての動物研究は、国立衛生研究所 (NIH) の動物研究ガイドライン (動物プロトコル番号 21-0187) に従って、セントルイスのワシントン大学の施設内動物管理使用委員会によって審査および承認されました。

自由に動くマウスに US 刺激を与えるために、小型化されたウェアラブル US トランスデューサーを設計しました。トランスデューサは、中心周波数 3.2 MHz、口径 13 mm、幾何学的焦点深度 10 mm のチタン酸ジルコン酸鉛セラミック共振器 (DL-43、DeL Piezo Specialty) を使用して作成されました。すべてのトランスデューサーは、ex vivo マウス頭蓋骨の有無にかかわらず、脱気および脱イオン水中でハイドロフォン (HGL-200、Onda) によって校正されました。 US トランスデューサの半値全幅は、横方向と軸方向でそれぞれ 0.8 mm と 3.8 mm でした。

ウェアラブル US トランスデューサは、実験前にマウスの頭蓋骨に接着されたベースプレート上の「プラグイン」設計によってマウスの頭に取り付けられました (拡張データ図 1)。ベースプレートを接着するために、マウスに麻酔をかけ、定位フレームを使用して頭を固定しました。マーカーペンを定位フレームに取り付け、頭蓋骨上に点を描き、ブレグマを基準とした座標（ブレグマに対して AP = 0.2 mm および ML = 0.2 mm）を使用して POA 領域を示しました。ベースプレートは、インサートを使用してマウスの頭蓋骨の上部に移植されました。インサートには中央に穴があり、目的の脳領域をターゲットにするために頭蓋骨上の点と位置合わせされました。このターゲティングプロセスの後、インサートが取り外され、接着セメントを使用してベースプレートが頭蓋骨に接着されました。オフターゲット対照実験では、ベースプレートを皮質（ブレグマに対してAP = 3.0 mmおよびML = 0 mm）またはPOAと同じ深さに位置する腹側海馬（AP = −2.7）をターゲットに移植しました。 mm、ML = 2.7 mm、DV = −5.0 mm）。ベースプレート移植後、動物を手術から回復させ、少なくとも 3 日間ベースプレートに適応させました。各 US 刺激実験の前に、ウェアラブル US トランスデューサーを脱気 US ゲル (Aquasonics) で満たし、イソフルラン (1 ～ 1.5% イソフルラン) を使用した軽い麻酔下でマウス頭部のベースプレートに差し込みました。麻酔の影響を最小限に抑えるために、この準備の合計時間は長くても 15 分でした。米国のターゲット深度 (DV 方向) は、円錐形のハウジングの高さをカスタマイズすることによって制御されました。凹面型トランスデューサーの焦点距離は約 8 mm でした。トランスデューサーハウジングの高さは、深さ 5 mm にある POA および腹側海馬 (オフターゲットコントロールとして) をターゲットにするために、約 3 mm になるように設計されました。トランスデューサーハウジングの高さは、深さ 1 mm の皮質をターゲットにするために 7 mm になるように設計されました。ウェアラブル US の焦点深度 (頭蓋骨に関連) は、生体外マウスの頭蓋骨を使用したハイドロホン校正によって検証されました (拡張データ図 1)。その後、マウスを麻酔から回復させ、最初の刺激の前に約 90 分間行動試験プラットフォームに慣れさせました。ベースプレートの設置とウェアラブル US トランスデューサーの設計は、中心周波数 (ラット実験では 1.5 MHz) とターゲット座標 (AP = 0 mm、ML = 0 mm、DV = ~8.5 mm) を除いて、ラット実験でも同様でした。

US 刺激は以下のパラメーターを使用して実行されました: 基本周波数はマウスで 3.2 MHz、ラットでは 1.5 MHz、ピーク負音圧 (頭蓋骨の減衰を考慮したその場圧力) はマウスで 1.6 MPa、ラットで 1.4 MPa、デューティサイクル 50 %、パルス繰り返し周波数 10 Hz、刺激持続時間 10 秒、刺激間隔 30 秒、刺激数 6 (マウス) または 20 (ラット)。パラメータ研究では、刺激持続時間 (2 ～ 10 秒) と音圧 (0.4、0.8、1.2、1.6 MPa) を変化させましたが、他のパラメータは同じに保たれました。 US 刺激による聴覚経路の活性化を避けるために、以前に報告された方法 53 を使用して、各 US 波形の最初と最後に平滑化エンベロープを適用しました。波形は、広帯域周波数成分の生成を減らすために波形の最初と最後にガウス関数エンベロープを適用することによって、MATLAB (R2021a、Mathworks) で生成されました。パルス繰り返し周波数は 10 Hz で、これはマウスの可聴範囲外です 54,55。次に、プログラムされた波形は関数発生器 (33500B、Agilent) に入力され、パワーアンプ (1020L、ENI) を介して増幅され、US トランスデューサーに送信されました。 85070E 誘電体プローブキット (Agilent Technologies) を備えた E5061A ENA ネットワークアナライザで測定した共振周波数におけるトランスデューサインピーダンスの実部は 31 ～ 59 オームの範囲内であったため、電気インピーダンスマッチングは必要ありませんでした。完全なインピーダンス整合に必要な 50 オームに十分近い値です。

US 刺激の前、最中、後の表面体温を、熱画像カメラを使用して記録しました。ウェアラブル US トランスデューサーを取り付けたマウスを、高さ 20 cm × 幅 10 cm × 長さ 10 cm の箱であるオープンフィールド試験プラットフォームに入れました。赤外線熱画像カメラ (FLIR E54 カメラ、FLIR Systems) をボックスの上 60 cm に配置し、FLIR ResearchIR (v.4) ソフトウェアでマウスの体温を捕捉しました。正確な表面温度測定を確実にするために、実験開始前に動物の背中の毛皮をバリカンを使用して取り除いた。この脱毛手順は、US+ および US- 対照グループの両方を含むすべての実験で実行されました。ウェブカメラ (C920、Logitech) をサーマルカメラの隣に配置し、サーマルカメラと同期して Bonsai (v.2.7) ソフトウェアを使用してマウスの動作をキャプチャしました。すべての実験において、周囲温度は約 22 °C で一定に保たれました。 TBAT は、FLIR ツール (v.6.4)、Bonsai、および MATLAB ソフトウェアの組み合わせを次の手順で使用して自動的に計算されました: (1) BAT の中心を体長の 25% と推定することにより、Bonsai 内の BAT の位置を追跡します。体の重心の前方。 (2) MATLAB を使用して、特定された BAT 位置を中心とする半径 3 mm の円によって定義される対象領域内の平均温度を計算します。尾部温度は、尾部の近位 1 cm を中心とする直径 2 mm の円形の関心領域を選択することによって手動で計算されました。 BAT 温度の最大変化（最大 ΔTBAT）は、US 開始後 7 ～ 12 分以内に得られた最低 BAT 温度と、平均体温として定義されるベースライン体温との差を計算することによって計算されました。 US 刺激の 15 分前に測定。この計算は、より正確な結果を得るために、生の信号にローパスフィルターを適用してカメラによる高周波変動を除去した後に実行されました。

中核体温 (Tcore)、酸素消費量 (VO2) および RQ 記録を測定するために、各マウスを温度制御された総合実験動物モニタリングシステム (CLAMS) (Columbus Instruments) 内の代謝ケージに収容しました。 US トランスデューサーは、回転ジョイントアダプターを使用して代謝ケージの上部に取り付けられ、マウスがワイヤのもつれなしにウェアラブル US トランスデューサーを備えたケージ内で自由に移動できることを確認しました。各実験の前に、マウスを最初に 1 日間 CLAMS に適応させました。酸素消費量 (VO2) と二酸化炭素生成速度 (VCO2) は、OxyMax 高速センサー (Columbus Instruments) を使用して約 3 分ごとに 8 つのケージで 20 秒間連続して測定されました (エアラインブリードは 18 秒、測定は 2 秒)。 CLAX 統計ソフトウェアを使用して記録されました。代謝ケージ内のマウスには、代謝記録と同期して深部体温を記録するための遠隔測定温度センサー (TA-XS、Stellar Telemetry、TSE Systems) も埋め込まれました。実験中、マウスには食物と水を自由に摂取させた。中核体温の最大変化（最大ΔTcore）は、US開始後30分以内に得られた最低体温とベースライン体温（5日間の平均体温として定義）との差を計算することによって計算されました。 -分ウィンドウは US 刺激の 1 分前に発生します)。最大酸素消費速度変化（max ΔVO2）も同様の方法で計算しました。最大ΔRQは、USの開始後45～55分のウィンドウ内で観察された最低RQとベースライン代謝率との差を決定することによって計算されました。ベースライン代謝率は、2分前に発生した28分ウィンドウ内で測定された平均RQとして定義されました。米国の刺激。 1 匹のマウスは、テレメトリセンサーの故障に起因する不完全な記録のため、図 2c の Tcore 曲線から除外されました。開始は、Tcore または VO2 のいずれかが、ベースラインの平均値 – ベースラインの 2 × sd として定義される閾値よりも低かった時点でした。 UIH の終了時間は、Tcore が 34 °C に戻った時間でした。次に、UIH の合計期間を、UIH の開始から終了までの期間として定義しました。 ECGenie システム (Mouse Specifics) を使用して、覚醒しているマウスの ECG を記録しました。心拍数は、EzCG Signal Analysis Software (v.7.0、Mouse Specifics) を使用して分析しました。さまざまな周囲温度で UIH の効果をテストするために、CLAMS システム内の温度が ~6 °C、~22 °C、または ~30 °C に維持されるように設定しました。マウスは、実験前にあらかじめ設定された周囲温度で 1 日間、最初に CLAMS に適応させました。適応後、マウスが特定の周囲温度 (6 °C、22 °C、または 30 °C) にあるときに、前述と同じプロトコルを使用してマウスに US 刺激を送達しました。

US 誘発脳温度上昇は、以前の論文で説明したのと同様の方法を使用し、4.7T MR スキャナー (Agilent/Varian DirectDrive Console) を使用した生体内 MR 温度測定によって測定されました。位相画像は、フリップ角 20°、TR 10 ms、TE 4 ms、スライス厚 1.5 mm、60 × 60 mm フィールドのマトリックスサイズ 128 × 128 で連続的に適用されるグラディエントエコーイメージングシーケンスを使用して取得されました。視界の。位相画像は、ThermoGuide ソフトウェア (v.1.3.4、Image Guided Therapy) を使用してリアルタイムで処理され、プロトン共鳴周波数シフト法に基づいて温度画像が生成されました。 US トランスデューサープローブ内の温度上昇は、光ファイバー温度計 (Luxtron、現在は LumaSense Technologies) を使用して測定されました。光ファイバー温度計を US トランスデューサーコーンに挿入し、マウスの頭の上と圧電材料の下に置き、トランスデューサープローブの温度上昇を測定しました。

フィードバック制御システムは、フィードバックコントローラー (MATLAB およびオープンソース Arduino UNO R3 マイクロコントローラー)、感知要素 (遠隔測定深部体温センサー)、および作動デバイス (US) を使用して開発されました。閉ループフィードバック制御システムの概念を図 3 に示します。フィードバック制御システムは、1 分間隔で Tcore 測定値を継続的に受信しました。検出された Tcore > Tset (Tset = 34 °C) の場合、システムは US をオンにしました (ピーク負音圧 1.6 MPa、デューティサイクル 50%、パルス繰り返し周波数 10 Hz、刺激持続時間 10 秒、インターバル刺激間隔は 20 秒、刺激数は 6）。 Tcore ≤ Tset の場合、米国はオフでした。マウスは US トランスデューサを長期間装着する必要があるため、マウスの動きに合わせて US トランスデューサケーブルが自由に回転できるように、360 度回転するスリップリング (Adafruit) を改造した特別なロータリージョイントケーブルコネクタを設計しました。総記録時間は 30 時間で、マウスはフィードバック制御された US 刺激を 24 時間受けました。水と餌はマウスに自由に摂取させた。複数回の刺激後の US ゲル内の気泡形成に起因する余分な音響減衰を補償するために、12 時間の刺激後に音圧を 10% 増加させ、刺激数を 8 に増加しました。実験の前後にマウスとケージ内の餌の重量を測定しました。

POA および DMH 領域における US 誘発ニューロン活動を、GCaMP シグナルのファイバー測光記録によって調査しました。記録の 1 か月前に、マウス脳アトラスに従って決定された座標を使用して、定位注射によって AAV5-Syn-GCaMP6s を POA または DMH 領域に注射しました:POA の DV = −5.0 mm、AP = 0.2 mm、および ML = 0.2 mm ; DMH の場合、DV = −5.2 mm、AP = −1.8 mm、ML = 0.2 mm。 POA での記録のために、US トランスデューサーベースプレートをマウスの頭蓋骨に取り付け、その中心穴がウイルス注射中に開けられた穴と一致するようにしました。光ファイバーカニューレ (MFC_200/245-0.37_6mm_ZF1.25_FLT、Doric Lenses) をベースプレートの穴を通して注射部位の約 200 μm 上に埋め込み、ウイルス注射中に穴を開けました。この設計により、POA 内の US 焦点領域とカニューレの先端の位置合わせが可能になりました。 DMH での記録のために、中心から 2 mm 離れた位置に穴のあるベースプレートが埋め込まれ、この穴を通してカニューレが脳に挿入されました。このプレート設計により、POA と位置合わせされたプレートの中心を通る US 刺激が可能になり、測光記録は DMH 領域で行われました。次に、カニューレとベースプレートを接着セメントで固定し、安定させました。次いで、マウスを手術から１週間回復させた。

US 刺激とファイバー測光記録を同時に行うためのウェアラブル US トランスデューサーは、光ファイバーを挿入するための直径 2 mm の穴をドリルで開けることによって構築されました。穴は、POA をターゲットとする場合はトランスデューサーの中心に位置し、DMH をターゲットとする場合は中心から 2 mm 離れて配置されました。トランスデューサーをベースプレートに差し込みました。嵌合スリーブをトランスデューサの穴に通し、ステンレス鋼のフェルールを移植されたカニューレに接続しました。このファイバーは、励起性青色光 (波長 470 nm、パワー 4%) を伝送し、GCaMP6s が放出する光子を収集しました。 GCaMP6s シグナルを収集し、デジタル化し、US 刺激と同期して測光システム (FP3002、Neurophotometrics) で測定しました。 LEDからの測光データと同期信号の取得にはオープンソースソフトウェアBonsai（v.2.7）を使用しました。

測光データは、US 刺激の前、最中、後に取得されました。取得したデータは、以前に報告された方法56を応用した方法を使用して処理されました。データは、まずハイパスフィルターを使用して漂白除去され、MATLAB 'zscore' 関数を使用して az スコアに変換されました。ピークは、MATLAB の「findpeaks」関数を使用して特定されました。ピーク振幅、Z スコアの平均、およびピーク周波数は、US 前 (US 刺激直前の 5 秒間)、US 中 (US 刺激中の 10 秒間)、US 後 (US 刺激終了直後の 15 秒間) に計算されました。）。神経活性化の開始時間は、US の開始から、US 前の z スコア > (平均 + 3 × sd) として定義される、うまく誘発された Ca2+ 活動の開始までの時間として決定されました。

さらに、US トランスデューサーと光ファイバーの位置を確認するために、9.4T 小動物 MRI スキャナー (BioSpec 94/20 USR; Bruker BioSpin MRI、エットリンゲン) を使用してマウスの MRI を実施しました。マウスを２％イソフルラン下で麻酔し、ＲＦボリュームコイル（ＢｒｕｋｅｒＢｉｏＳｐｉｎＭＲＩ）内に置いた。 T2 強調高速スピンエコー画像は、次の設定を使用して取得されました。TR/TE は 2,200/43.53 ミリ秒。スライス厚さは0.25mm。面内解像度0.125 × 0.125 mm2。マトリクスサイズは 256 × 256。フリップ角は 180°。平均8。

US 刺激の約 1.5 時間後、PBS、続いて 4% パラホルムアルデヒド (PFA) による経心臓灌流によってマウスを屠殺しました。脳を収集し、４％ＰＦＡ中で一晩固定し、凍結切片のために３０％スクロース（１×ＰＢＳ中）中で平衡化した。固定された脳は、免疫組織化学染色および in situ ハイブリダイゼーション分析のために 15 μm のスライスに切片化されました。

免疫組織化学染色は、以下の一次抗体を使用して実行されました:抗 NeuN (Abcam、カタログ番号 104225、1:1,000 希釈)、抗 GFAP (Abcam、カタログ番号 207165、1:1,000 希釈)、抗 Iba1 ( Abcam、カタログ番号 178846、1:1,000 希釈) および抗 c-Fos 抗体 (Cell Signaling Technology、カタログ番号 2250、1:500 希釈)。 RNA-scope アッセイを使用した FISH 染色は、RNA-scope Multiplex Fluorescent v2 キット (Advanced Cell Diagnostics (ACD)、323110) の製造元のプロトコールに従って実行されました。使用した RNA スコーププローブは、Mm-FOS (ACD、316921)、Mm-Adcyap1-C2 (ACD、405911-C2)、および Mm-Trpm2-C3 (ACD、316831-C3) でした。

染色された脳スライスは、20倍の対物レンズを備えたマルチチャンネルKeyence BZ-X800顕微鏡およびBZ-X800 Analyzerソフトウェア（Keyence Corp）を使用して画像化されました。さまざまな脳領域にわたる陽性細胞の割合を定量化するために、以前に報告された MATLAB の半自動登録方法に基づいて脳スライスを Allen Brain Atlas に登録しました 57。タンパク質または RNA マーカーの平均蛍光強度が推定細胞領域内で計算され、全脳バックグラウンドの平均 + 3 × sd よりも高ければ陽性と判定されました。

US刺激の約1時間後、マウスに氷冷したリン酸緩衝生理食塩水(1×PBS)を経心臓的に灌流した。 US処理マウス（US+、n = 4）と偽マウス（US-、n = 4）の両方からPOA領域を各脳から抽出し、新たに調製した核抽出バッファー0.4 mlを含むDounce Homogenizer（Kimble）でホモジナイズしました。 (250 mM スクロース、25 mM KCl、5 mM MgCl2、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.1% Triton X-100 および 0.2 U μl-1 組換えリボヌクレアーゼ阻害剤 (Invitrogen RNaseOUT)) A ペッスルで 4 回ストロークを適用続いて B 乳棒で 8 回ストロークします。対照群の４匹のマウスとＵＳ群の４匹のマウスのホモジネートを核単離のためにプールした。サンプルを 30 µm のセルストレーナーチューブ (Corning Falcon) で濾過し、4 °C、500 g で 5 分間遠心分離して核を沈殿させました。解離した核を１回洗浄し、核保存緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．２Ｕμｌ−１組換えリボヌクレアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ）で穏やかに再懸濁した。単核 RNA シーケンス用にニューロン核を精製するために、核懸濁液を Alexa Fluor 488 結合マウス抗 NeuN 抗体 (Millipore sigma、MAB377X、1:200 希釈) とともに氷上で 30 分間インキュベートしました。インキュベーション後、核を1回洗浄し、1μg ml-1 DAPIを含む核保存緩衝液で再懸濁した。サンプルを30μmのセルストレーナーチューブで濾過し、特定のゲート戦略を備えたFlowJo（v.10.8）ソフトウェアを使用してFACS（MoFlo、Beckman Coulter）を使用して短時間で分類しました（補足図1）。ニューロン核をDAPI+/NeuN+核で選別し、1.5mlエッペンドルフチューブに回収した。約 25,000 個のニューロン核がコントロールグループと US グループのそれぞれから収集され、単一細胞 RNA シーケンス (10x ゲノミクス) のために GTAC@MGI に送られました。 Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM、ライブラリおよびゲルビーズキット v.3.1 (10x Genomics) を使用して、ニューロン核を直ちに Chromium Single Cell Processor (10x Genomics) にロードし、単一核からの RNA バーコーディングを行いました。メーカーの指示に従ってシーケンシングライブラリを構築し、得られた cDNA サンプルを高感度 DNA チップを使用して Agilent Bioanalyzer で分析して cDNA 濃度を測定しました。サンプルを組み合わせて、Illumina Nova Seq 6000 で実行しました。

生のシーケンスデータは、デフォルトパラメーターを備えた参照マウスゲノム (mm10-2020-A) に基づいて 10x Genomics CellRanger パイプライン (v.6.1.1) を使用して処理されました。データは最も飽和度の低いサンプルに対して正規化されており、コントロールグループ (マウス n = 4 匹) では細胞あたり 83,113 リード (平均)、3,207 遺伝子 (中央値)、および 7,353 個の固有分子識別子 (UMI) カウント (中央値) となりました。 UIH グループ (n = 4 マウス) には、細胞あたり 77,898 のリード、2,998 の遺伝子、および 6,498 の UMI カウントが含まれていました。

R Studio (R v.4.2) の Seurat パッケージ (v.4.0) を使用して、単核 RNA-seq データを処理しました。データはまず次の基準でフィルタリングされました。ミトコンドリア数が 5% を超える細胞は、広範囲のミトコンドリア汚染を示していると考えられ、濾過されました。固有の特徴数が 7,500 を超えるセルは、ダブレットまたはマルチプルとみなされ、フィルター処理されました。固有の特徴数が 200 未満のセルもフィルターされました。フィルタリング後、すべての Seurat オブジェクトがマージされました。正規化には、スケール係数 10,000 の「LogNormalize」メソッドが使用されました。「FindVariable features」関数を使用して、上位 4,000 個の可変特徴を抽出しました。データは、ScaleData 関数を使用してミトコンドリアのパーセントに従ってスケーリングされました。 IEG はクラスタリングに影響を与える可能性があります。したがって、次のデータ処理パイプラインの前に、特徴遺伝子のリストから 139 個の IEG58 をすべて削除しました。次に、「RunPCA」機能を使用して主成分分析を実行しました。上位 40 個の主成分を使用して、「FindNeighbours」関数と「FindClusters」を使用して最初の 34 個のクラスターを特定しました。クラスタリングの結果は、UMAP プロットを使用して視覚化されました。

神経細胞として同定されたクラスターは、Kif5c および Camk2a58 の平均発現レベルをチェックすることによるさらなる分析に使用されました。 22,612個のうち合計21,886個が神経細胞であることが確認された。「FindAllMarkers」機能を使用して、各クラスター内の重要な遺伝子を検索しました。ニューロン集団をさらに処理して、前述の方法を繰り返すことによってニューロンのサブタイプを特定しました。クラスタリングにより、11 種類の興奮性神経細胞タイプと 24 種類の抑制性神経細胞タイプが同定されました。興奮性ニューロンの階層ツリー構築を使用して、k-means クラスタリングに基づく Adcyap1、Qrfp、Esr1 (参考文献 11、12、15) などの以前に報告された特徴に基づいて、不眠関連ニューロンを特定しました。以前の文献59、60、61から要約されたTRPおよびPIEZOイオンチャネルの平均発現レベルを、すべての休眠関連クラスターにわたって調べた。

Trpm2 shRNA (m) (カタログ番号 sc-42675-V、Santa Cruz Biotechnology) を含むレンチウイルス粒子を使用して、TRPM2 イオンチャネルの発現とスクランブル shRNA (m) (カタログ番号 sc-42675-V) を含むレンチウイルス粒子をノックダウンしました。 108080、Santa Cruz Biotechnology)を対照として使用した。次に、1.5μlのshRNA溶液（ウイルスの106感染単位）を両側のPOA領域に微量注入した（総量3μl）。注射は、POA 内の十分なレンチウイルス粒子数を確保するために 3 日ごとに 3 回実行されました。最初の注射から 3 週間後、マウスは前述のように POA 領域に US 刺激を受けました。ウェスタンブロットを実行して、ノックダウングループのPOA領域におけるTRPM2の発現レベルを評価し、スクランブルshRNAを注入したコントロールグループの発現レベルと比較しました。

TRPM2 イオンチャネルの US 感度を調べるために、以前に報告された in vitro カルシウムイメージング法 34 を使用しました。 HEK293T 細胞 (CRL-3216、ATCC) を、10% FBS、2 mM l-グルタミン、100 μg ml-1 ピルビン酸ナトリウム、1% 非必須アミノ酸、および 1 %ペンストレプト。リポフェクタミン 2000 を使用して、TRPM2 イオンチャネルを細胞内で過剰発現させました。トランスフェクションの 1 日前に、抗生物質を含まない 500 μl 増殖培地に 0.5 ～ 1 × 105 個の細胞を 48 ウェルプレートの 1 ウェルおきに播種しました。次いで、まず、２μｌのリポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０μｌのＯｐｔ－ＭＥＭ中の０．８μｇのＴｒｐｍ２ＤＮＡプラスミド（プラスミド５３９２０、Ａｄｄｇｅｎｅ）と混合した。次いで、５０μｌの複合体を細胞に添加して、ＵＳ刺激を適用する前に２日間トランスフェクションを可能にした。 Ca2+ インジケーターである Fluo-4 AM (Thermo Fisher Scientific) を使用して、Q キャプチャ (pro 7) を使用して 2.4 フレーム s-1 のフレームレートで蛍光顕微鏡を使用し、US 刺激に対する Ca2+ 応答の空間ダイナミクスを画像化しました。ソフトウェア。 TRPM2 の機能的発現は、アゴニスト ADPR (最終濃度 100 μM、アデノシン 5'-ジホスホリボースナトリウム塩、A0752-25MG、Sigma-Aldrich) に応答した Ca2+ シグナルを観察することによって検証されました。記録開始から 30 秒後、カスタマイズされた US 刺激セットアップを使用して US 刺激 (周波数 1.7 MHz、音圧 1.0 MPa、デューティサイクル 40%、PRF 10 Hz、持続時間 60 秒) を細胞に適用しました。以前の研究で説明したとおりです34。 US トランスデューサーの違いにより、in vivo US 刺激プロトコルと同じ US パラメーターは使用しませんでした。 TRPM2+ 細胞の活性化の開始時間は、US の開始から、うまく誘発された Ca2+ 活性の開始までの時間として定義され、US 刺激前のシグナルの ΔF/F > (mean + 3 × sd) として定義されました。。細胞培養チャンバーの温度は、光ファイバー温度計を使用して監視されました。光ファイバー温度計の先端は、ＵＳ波伝播の干渉を避けるために、トランスデューサーの焦点に約１ｍｍ近い位置に挿入された。ブロッカー研究では、US 刺激の 1 分前に、5 μl のアンタゴニスト 2-APB (TOCRIS) を 500 μl の細胞培養液に最終濃度 30 μM まで添加しました。

統計分析は GraphPad (Prism) で実行され、統計分析方法はすべての図のキャプションに記載されています。 P < 0.05 の場合、統計的差異は有意であるとみなされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この調査で提示されたデータは、ソースデータで入手できます。単核 RNA 配列解析で使用された元のデータセットは、NCBI でアクセスでき、Gene Expression Omnibus アクセッションコード GSE228180 でアーカイブされています。この研究で使用されたマウスの脳アトラスは、Allen Brain Atlas から入手できます。この研究の結果を裏付ける追加情報およびリソースおよび試薬のリクエストは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

ストーリー、KB 寒さの中で：哺乳類の冬眠の生化学的調節 – ミニレビュー。老年学 56、220–230 (2010)。

論文 PubMed Google Scholar

RJ ホック冬眠の宇宙旅行への応用の可能性。エアロスプ。医学。 31、485–489 (1960)。

CAS PubMed Google Scholar

Cerri, M. 冬眠中の意識と合成的無気力。Ｊ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ．神経科学。 16、S19–S26 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

心停止後の低体温研究グループ。心停止後の神経学的転帰を改善するための軽度の治療的低体温療法。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 346、549–556 (2002)。

記事 Google Scholar

Cerri, M.、Hitrec, T.、Luppi, M. & Amici, R. 遠く離れても冷静に: 冬眠を宇宙探査に活用する。神経科学。生物行動。改訂 128、218–232 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Cerri, M. et al. 宇宙旅行のための冬眠: 放射線防護への影響。生命科学。スペース解像度 11、1–9 (2016)。

記事 Google Scholar

アーカンソー州ドーとワシントン州スプリアー輸血によってジリスに誘発される冬眠。サイエンス 163、298–299 (1969)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ボウマ、HR 他。休眠の誘導: 生物医学用途のための自然な代謝抑制の模倣。Ｊ．Ｃｅｌｌ．生理。 227、1285–1290 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Blackstone, E.、Morrison, M.、Roth, MB H2S はマウスに仮死状態のような状態を引き起こします。サイエンス 308、518 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ドリュー、KL et al. 哺乳類の冬眠の中枢神経系調節：代謝抑制と虚血耐性への影響。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． 102、1713–1726 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hrvatin, S. et al. マウスの休眠を制御するニューロン。ネイチャー 583、115–121 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

高橋 TM 他げっ歯類では、個別の神経回路が冬眠のような状態を誘発します。ネイチャー 583、109–114 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cerri, M. et al. 体温調節による寒さ防御のための中枢神経経路のニューロンが阻害されると、ラットに仮死状態が誘発されます。 J. Neurosci. 33、2984–2993 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tupone, D.、Madden, CJ & Morrison, SF A1 アデノシン受容体 (A1AR) の中枢性活性化は、ラットにおいて低体温の無気力状態を誘発します。 J. Neurosci. 33、14512–14525 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、Z.ら。エストロゲン感受性内側視索前野ニューロンはマウスの休眠を調整する。ナット。共通。 11、1–14 (2020)。

記事 Google Scholar

Legon, W. et al. 経頭蓋集束超音波は、ヒトの一次体性感覚皮質の活動を調節します。ナット。神経科学。 17、322–329 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エリアス、WJら。本態性振戦に対する集束超音波視床切除術のランダム化試験。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 375、730–739 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Tufail, Y. et al. 経頭蓋パルス超音波は、無傷の脳回路を刺激します。ニューロン 66、681–694 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

パン、N.ら。超音波脳深部刺激はマウスの体温を調節します。 IEEEトランス。神経系リハビリ。工学 30、1851 ～ 1857 年 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

Folloni, D. et al. マカクの前頭前皮質の超音波変調は、単位割り当てに関連する活動と行動を選択的に変化させます。科学。上級 7、eabg7700（2021）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kubanek, J. et al. 超音波による遠隔の脳領域固有の選択行動の制御。科学。上級 6、eaaz4193 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

フォメンコ、A.ら。人間の運動皮質の興奮性と行動に関する低強度超音波パラメータの体系的な検査。 eLife 9、e54497 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi、Z.ら。人間の休眠: 自然から得た洞察を有人深宇宙探検に応用します。バイオル。改訂 96、642–672 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Ambler, M.、Hitrec, T.、Wilson, A.、Cerri, M. & Pickering, A. 視床下部背内側のニューロンは、マウスの無気力を促進し、延長し、深めます。 J. Neurosci. 42、4267–4277 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

砂川、GA & 高橋、M. マウスの毎日の休眠中の代謝低下は、体温調節システムの感受性の低下によって支配されます。科学。議員 6、37011 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Snapp, BD & Heller, HC ジリス (Citellus Lateris) の冬眠中の代謝の抑制。生理。ズール。 54、297–307 (1981)。

記事 Google Scholar

Iliff, BW & Swoap, SJ 中枢アデノシン受容体シグナル伝達は、マウスの毎日の休眠に必要です。午前。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．レギュラー。統合します。コンプ。生理。 303、477–484 (2012)。

記事 Google Scholar

Butler, A.、Hoffman, P.、Smibert, P.、Papalexi, E.、Satija, R. さまざまな条件、技術、種にわたる単一細胞トランスクリプトームデータの統合。ナット。バイオテクノロジー。 36、411–420 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

モフィット、JR 他。視床下部の視索前領域の分子的、空間的、機能的単一細胞プロファイリング。サイエンス 362、eaau5324 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu, Z.、Eils, R. & Schlesner, M. 複雑なヒートマップは、多次元ゲノムデータのパターンと相関関係を明らかにします。バイオインフォマティクス 32、2847–2849 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Qiu、Z.ら。機械感受性イオンチャネル piezo1 は、in vitro でのニューロンの超音波刺激を大きく媒介します。 iScience 21、448–457 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ホフマン、BU et al. 集束超音波は、部分的には機械的にゲートされたイオンチャネル PIEZO2 を介して、哺乳動物の末梢ニューロンの活動電位を励起します。手順国立アカデミー。科学。 USA 119、e2115821119 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ああ、S.J. 他。星状細胞の TRPA1 を介した超音波神経調節。カー。バイオル。 29、3386–3401 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヤン、Ｙら。非侵襲的かつ細胞型特異的な深部脳神経調節のための音響遺伝学。脳の刺激。 14、790–800 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, S.、Mittelstein, DR、Hurt, RC、Lacroix, J. & Shapiro, MG 集束超音波は、機械感受性のカルシウムの蓄積とイオンチャネルの増幅を介して皮質ニューロンを興奮させます。ナット。共通。 13、493 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roh, E. & Kim, MS エネルギー代謝の脳調節。内分泌。メタブ。 31、519–524 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

趙、ZDら。体温を制御する視床下部の回路。手順国立アカデミー。科学。 USA 114、2042–2047 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morrison, SF、Madden, CJ & Tupone, D. 褐色脂肪組織の熱産生とエネルギー消費の中枢神経調節。細胞メタブ。 19、741–756 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fedorenko, A.、Lishko, PV & Kirichok, Y. 褐色脂肪ミトコンドリアにおける脂肪酸依存性の UCP1 脱共役のメカニズム。セル 151、400–413 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oelkrug, R.、Heldmaier, G. & Meyer, CW 野生型および UCP1 除去マウスにおける休眠パターン、覚醒率、および休眠移行の時間的組織化。 J.コンプ。生理。 B. 181、137–145 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Geiser, F. 冬眠および毎日の無気力中の代謝率と体温の低下。アンヌ。 Rev. Physiol. 66、239–274 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Song, K. et al. TRPM2 チャネルは視床下部の熱センサーであり、発熱を制限し、低体温症を引き起こす可能性があります。サイエンス 353、1393–1398 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

樫尾 M. & 富永 M. TRPM2 チャネル: 温度感受性代謝センサー。チャンネル 11、426 ～ 433 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

バルトーク、Á. & Csanády, L. デュアル増幅戦略により、TRPM2 チャネルが超高感度の中央熱検出器に変わります。手順国立アカデミー。科学。 USA 119、e2212378119 (2022)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

サイペス、AM et al. 成人における褐色脂肪組織の同定と重要性。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 360、1509–1517 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hampton, M.、Melvin, RG & Andrews, MT 自然冬眠の生理学的極限における褐色脂肪組織のトランスクリプトーム分析。 PLoS ONE 8、e85157 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ソト、M.ら。ピルビン酸は肥満マウスの休眠を誘発します。手順国立アカデミー。科学。 USA 115、810–815 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, J.、Kaasik, K.、Blackburn, MR & Cheng, CL 一定の暗闇は、哺乳類における概日代謝シグナルです。自然 439、340–343。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Oeltgen 、 PR 、 Nilekani 、 SP 、 Nuchols 、 PA 、 Spurrier 、 WA & Su 、 TP オピオイドと冬眠に関するさらなる研究: デルタオピオイド受容体リガンドは、夏に活動するジリスにおいて選択的に冬眠を誘発した。生命科学。 43、1565–1574 (1988)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

TR ジンカ氏、O. トイエン氏、クアラルンプール州ドリュー季節は、アデノシン A1 受容体によって媒介される無気力状態への入りを促進するために、北極の冬眠状態で脳を準備します。 J. Neurosci. 31、10752–10758 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zakharova, NM、Tarahovsky, YS、Komelina, NP、Fadeeva, IS & Kovtun, AL フィードバック制御薬物投与によるラットの長期薬理学的無気力。生命科学。スペース解像度 28、18–21 (2021)。

記事 Google Scholar

Truong, DH、Eghbal, MA、Hindmarsh, W.、Roth, SH & O'Brien, PJ 硫化水素毒性の分子機構。薬物メタブ。改訂 38、733–744 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

モハマドジャヴァディ、M. 他末梢聴覚経路の活性化を排除しても、超音波神経調節による運動反応には影響しません。脳の刺激。 12、901–910 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Reynolds, RP、Kinard, WL、Degraff, JJ、Leverage, N. & Norton, JN 人間とマウスの観点から見た実験動物施設内の騒音。混雑する。准教授研究室アニム。科学。 49、592–597 (2010)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バーハーゲン、L.ら。霊長類の皮質活性化に対する経頭蓋集束超音波のオフライン影響。 eLife 8、e40541 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ロンドン、TD 他食物へのアプローチと摂取に先立つ背側線条体経路の調整されたランプ化。 J. Neurosci. 38、3547–3558 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヤン、Ｙら。集束超音波による血液脳関門破壊のためのキャビテーション線量ペインティング。科学。議員9、1-10（2019）。

Google スカラー

Wu、YE、Pan、L.、Zuo、Y.、Li、X.、Hong、W. 単一細胞 RNA 配列を使用した活性化細胞集団の検出。ニューロン 96、313–329 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Nilius, B. & Owsianik, G. イオンチャネルの一過性受容体電位ファミリー。ゲノムバイオル。 12、1–11 (2011)。

記事 Google Scholar

コステ、B.ら。 Piezo1 と Piezo2 は、機械的に活性化される別個のカチオンチャネルの必須コンポーネントです。サイエンス 330、55–60 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Clapham、DE 細胞センサーとしての TRP チャネル。 Nature 426, 517–524 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アレン脳科学研究所。アレン・ブレイン・アトラス; http://mouse.brain-map.org/

リファレンスをダウンロードする

MRI スキャナーの技術的な問題については、JD Quirk の協力に感謝します。ワシントン大学 C.-K の L. Li 氏に感謝します。 Mo と X. Liu は、単核 RNA-seq データ解析に関する貴重な提案を提供してくれました。また、サーマルカメラを使用した体温画像処理のセットアップにご協力いただいた A. Norris 氏と A. Cone 氏にも感謝いたします。 FISH 染色スライスのイメージングを手伝ってくれた M. Rhodes に感謝します。漫画の一部は BioRender.com で作成されました。この研究は、NIH R01MH116981 (HC)、UG3MH126861 (HC)、R01EB027223 (HC)、および R01EB030102 (HC) によってサポートされました。 JRB は、NIH DP5 OD028125 およびバロウズウェルカム基金 CAMS no. によってサポートされています。 1019648。

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学生物医工学部

Yaoheng Yang、Jinyun Yuan、Dezhuang Ye、Zhontao Hu、Kevin Xu、Lu Xu、Yan Gong、Yimei Yue、Jianmin Cui、Hong Chen

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部病理学および免疫学部

レイチェル・L・フィールド & ジョナサン・R・ブレストフ

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部精神科

アレクサイ・V・クラヴィッツ

ワシントン大学、ワシントン州シアトル、依存症、痛み、感情の神経生物学センター、麻酔科、疼痛医学、薬理学、生物工学科

マイケル・R・ブルカス

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部放射線腫瘍科

ホン・チェン

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部脳神経外科

ホン・チェン

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部神経工学部門

ホン・チェン

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コンセプト化はHCとY.ヤンの責任でした。実験計画は HC、Y. Yang、JRB、MRB が担当しました。実験実施は Y. Yang、JY、RLF、DY、ZH、LX、KX、Y. Yue、YG が担当しました。結果調査は HC、 Y. Yang、JY、AVK、MRB、JRB 視覚化は HC と Y. Yang によって実行されました。資金獲得は HC の責任プロジェクト管理は HC が実施監督は HC、JRB、MRB、JC が実施原案の執筆は HC と Y. Yang が担当レビューと編集は HC、Y. Yang、JC、JY、RLF、DY、ZH、YG、KX、AVK、MRB、JRB によって行われました。

ホン・チェンさんへの手紙。

JRB には、現在の研究とは関係のない特許出願が係属中です。具体的には、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患の治療のためのミトコンドリア導入、アレルギー疾患の治療法、および免疫測定法におけるフック効果を克服する方法に関する。 JRB は、過去 12 か月間、DeciBio および Flagship Pioneering のコンサルタントを務めており、LUCA Science の科学諮問委員会のメンバーでもあります。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Metabolism は、この研究の査読への貢献について、Gerhard Heldmaier、Martin Jastroch、Saakurai Takeshi、Elsa Fouragnan に感謝します。主な取り扱い編集者: Christoph Schmitt、Nature Metabolism チームと協力。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(A) ウェアラブル超音波トランスデューサーの図。トランスデューサーは、マウスの頭に接着されたベースプレートに取り付けられました。超音波プローブ（USプローブ）とベースプレートの写真。ベースプレートインサートの写真も提供されます。中央に穴のあるベースプレートインサートは、ベースプレートの取り付け時にベースプレートの位置決めをガイドするために使用されます。ベースプレートの取り付け後にインサートを取り外しました。 (B) 脱気水槽内でハイドロフォンを使用して超音波プローブによって生成される音圧場を測定するための実験装置。ベースプレートを備えた生体外マウスの頭蓋骨を超音波プローブの前に置きました。 (C) マウスの頭蓋骨の存在下で軸方向焦点面と横方向焦点面で測定された音圧場。半値全幅で測定した焦点領域サイズは、軸方向に３．８ｍｍ、横方向に０．８ｍｍであった。

(A) 雌 (ピンク) および雄 (青) マウスにおける UIH 誘発の中核体温変化 (最大 ΔTcore) および代謝率変化 (最大 ΔVO2)。左側のプロットでは、US+ および US- グループの両方で n = 6 匹の雄マウス、US+ グループで n = 7 匹の雌マウス、US- グループで 8 匹の雌マウス。右のプロットでは、すべてのグループで n = 5 匹のマウス。 (B) 超音波刺激によって誘発された VO2 と Tcore の時間相関。米国の超音波処理はピンクのバーで示されます。 (C) VO2 と Tcore の開始時間の比較。 N = 7 匹のマウス。 (D) 低体温状態の持続時間の定量化。 N = 7 匹のマウス。 (E) 単一 US 刺激を受けたグループと長時間のフィードバック制御された超音波刺激を受けたグループにおける復温時間 (最低 Tcore から 34 °C まで) の定量化。単一の US 刺激グループでは N = 7 匹のマウス、フィードバック制御された超音波刺激グループでは 4 匹のマウス。エラーバーは sem を示します。各ドットは 1 匹のマウスを表します。 P 値は、(A および E) では対応のない両側 t 検定、C では対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

超音波刺激なしのグループ (US-)、POA で超音波刺激を受けたグループ (POA)、オフターゲットを含む 4 つのグループのベースラインに対する中核体温の変化 (ΔTcore) と計算された最大 ΔTcore対照群は皮質（Cortex）で超音波を受信し、オフターゲット対照群は腹側海馬（海馬）で超音波を受信します。右の図では、最大 ΔTcore は最低 Tcore、つまり US 前の平均 Tcore として計算されました。米国の超音波処理はピンクのバーで示されます。実線と影は平均値 ± sem を示します。エラーバーは sem を示します。各点は 1 匹のマウスを表します。 N = US グループのマウス 8 匹、POA グループのマウス 7 匹、Cortex グループのマウス 4 匹、海馬グループのマウス 6 匹。 P 値は、一元配置 ANOVA に続いて、各グループを US- と比較するダネットの事後検定を使用して計算されました。

ソースデータ

POA での超音波刺激後のニューロン、星状膠細胞、およびミクログリアの形態と数の評価。エラーバーは sem を示します。各ドットは 1 匹のマウスを表します。 N = 5 匹のマウス。 P 値は、対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

異なる周囲温度 (6 °C、22 °C、および 30 °C) で超音波刺激を受けたマウスの (A) 中核体温 (Tcore) および (B) 代謝率 (VO2)。米国の超音波処理はピンクのバーで示されます。実線と影は平均値 ± sem を示します。エラーバーは sem を示します。各点は 1 匹のマウスを表します。 Max ΔTcore と max VO2 は、超音波の開始後 70 分間以内に得られた最小値と、超音波の 1 分前に発生する 5 分間のウィンドウの平均体温として定義されたベースライン値との差を計算することによって計算されました。超音波刺激。すべてのグループに対して N = 4 匹のマウス。 P 値は、一元配置 ANOVA とそれに続くダネットの事後検定を使用して計算され、周囲温度 22 °C グループと比較されました。

ソースデータ

左：超音波刺激された脳（US+）および超音波処理されていない脳（US-）におけるc-Fosタンパク質の免疫蛍光染色。右: US+ グループと US- グループを比較した場合の、ターゲット POA 領域内のすべての細胞中の c-Fos+ 細胞の割合。 US+ グループでは N = 5 匹のマウス、US- グループでは 4 匹のマウス。エラーバーは、対応のない両側 t 検定を使用して計算された sem P 値を示します。

ソースデータ

対照ウイルスの注射を受けた偽マウス（偽）およびTRPM2発現をノックダウンするためのレンチウイルス-Sh-RNA注射を受けたマウス（TRPM2-KD）におけるTRPM2発現レベルのウエスタンブロット評価。エラーバーは、TRPM2-KD グループについては sem N = 4 匹のマウス、Sham グループについては 5 匹のマウスを示します。 P 値は、対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

WT および UCP1-KO グループの入場時 (A) および UIH 覚醒時 (B) の体温変化率 (ピーク ΔTcore 率) および VO2 変化率 (ピーク ΔVO2 率) の定量化。エラーバーは sem を示します。各ドットは 1 匹のマウス (メス) を表します。 WT グループでは N = 6 匹のマウス、UCP1-KO グループでは 5 匹のマウス。 P 値は、対応のない両側 t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

(A) (左) インビボでのマウス脳における超音波誘発加熱の冠状断面図 MR サーモメトリー画像。白い実線はマウスの脳の輪郭を示し、点線は超音波ビームを示します。 (右) 超音波を対象とした POA 領域内の温度変化 (ΔTTarget) が時間の関数として変化します。 (B) (左) 神経活性化開始時間は、US 刺激中の POA での Ca2+ 活性のファイバー測光記録から計算されました (図 4)。 (右) 神経活動開始時の対応する ΔTTarget。実線と影は平均値 ± sem を示します。各点は 1 回の 10 秒の超音波刺激を表します。

ソースデータ

(A) 時間の関数としての細胞培養チャンバー内の温度変化 (ΔTchamber)。 (B) (左) TRPM2+ 細胞の活性化開始時間を、TRPM2 過剰発現を有する in vitro HEK293 細胞の蛍光 Ca2+ 画像から計算しました (図 6)。 (右) TRPM2 活性化の開始時の対応する ΔTchamber。実線と影は平均値 ± sem を示します。各ドットは 1 つのセルを表します。

ソースデータ

フローサイトメトリーのゲート戦略。

POA で非侵襲的超音波刺激を受けたマウスの代表的な赤外線熱画像ビデオ。

統計ソースデータ。

未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

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転載と許可

ヤン、Y.、ユアン、J.、フィールド、RL 他。超音波によるげっ歯類における無気力のような低体温および低代謝状態の誘発。 Nat Metab 5、789–803 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42255-023-00804-z

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受信日: 2022 年 10 月 29 日

受理日: 2023 年 4 月 11 日

公開日: 2023 年 5 月 25 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00804-z

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